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    CO-IP沒(méi)有條帶的常見(jiàn)原因和解決的辦法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-13  點(diǎn)擊次數(shù): 6326次

    CO-IP 并不容易做,尤其是兩個(gè)蛋白豐度低,相互作用力較弱的時(shí)候。做 CO-IP 經(jīng)常會(huì)遇到?jīng)]有條帶的問(wèn)題。這里談?wù)?CO-IP 沒(méi)有條帶的常見(jiàn)原因和解決的辦法,更有獨(dú)門(mén)配方獻(xiàn)上。


    蛋白濃度過(guò)稀 

    絕大多數(shù)情況下,CO-IP 沒(méi)有條帶是由于蛋白濃度過(guò)稀。裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。但是,有些實(shí)驗(yàn)室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做 CO-IP。其實(shí),在大多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細(xì)胞裂解液。盡量使細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達(dá) 7-8 mg/ml 左右。這才會(huì)避免發(fā)生沒(méi)有條帶的情況。


    沒(méi)有裂解開(kāi) 

    很多時(shí)候,由于裂解液不夠強(qiáng)烈,蛋白質(zhì)復(fù)合物沒(méi)有分開(kāi),也會(huì)造成沒(méi)有條帶的問(wèn)題。解決辦法是:加溫和加少量的 SDS 增加變性能力。這里再介紹一個(gè)小竅門(mén):最初幾遍的漂洗 buffer 要和 IP 時(shí)的鹽濃度相同。純化蛋白的時(shí)候,如果用低鹽裂解細(xì)胞,高鹽漂洗去雜質(zhì),蛋白丟失較多。再奉獻(xiàn)一個(gè)獨(dú)門(mén)配方:20 mM Tris/HCl,pH7.6,100 mM  NaCl,20 mM KCl,1.5 mM MgCl2,0.5% NP-40 and protease inhibitors (0.5M PMSF)。包用包好。


    量不合適

    很多時(shí)候,CO-IP 沒(méi)有條帶,是由于蛋白量,珠子,抗體的量需要調(diào)整。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),一般 100ug 蛋白,3ug 抗體,30ug 珠子。如果不行,250ug 蛋白,5ug 抗體,或者 500ug 蛋白,7ug 抗體。


    抗體太坑

    抗體是 CO-IP 成敗的致命因素之一!必須是 IP 級(jí)別的抗體。說(shuō)句不好聽(tīng)的話,不要用國(guó)產(chǎn)抗體和 Santa Cruz 的抗體。這些抗體在做 CO-IP 的實(shí)驗(yàn)室里面已經(jīng)臭名遠(yuǎn)揚(yáng)了。坑人無(wú)數(shù)。大家就不要再重蹈覆轍了。 

    單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強(qiáng),背景低。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn),就是識(shí)別位點(diǎn)單一,而在 CO-IP 過(guò)程中,該位點(diǎn)很有可能與其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉,導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白而沒(méi)有條帶。所以,如果沒(méi)有十足把握,單抗的識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域,還是選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。至少不會(huì)出現(xiàn)沒(méi)有條帶的問(wèn)題。


    細(xì)胞數(shù)量太少 

    很多時(shí)候,CO-IP 沒(méi)有信號(hào)是由于細(xì)胞數(shù)量太少。一般是 145 mm 的培養(yǎng)皿,至少要長(zhǎng)到 50%以上。如果低于這個(gè)數(shù)目,CO-IP 就很有可能沒(méi)有信號(hào)。除非藥品和試劑非常非常昂貴,否則就不要節(jié)約這點(diǎn)細(xì)胞了。一旦 CO-IP 實(shí)驗(yàn)失敗,浪費(fèi)的時(shí)間可是更寶貴的。


    綜上所述,CO-IP 是比較難做的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。很多時(shí)候,能否成功取決于抗體和兩個(gè)蛋白的結(jié)合常數(shù),和 protocol 和實(shí)驗(yàn)操作本身的關(guān)系不大。以上,介紹了一些經(jīng)驗(yàn)體會(huì)和小技巧小竅門(mén),希望對(duì)大家有所幫助。


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