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    搞定內(nèi)參,駕馭 Western blot 已成功一半

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-15  點(diǎn)擊次數(shù): 1360次

    western blot 對(duì)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)新人而言,絕對(duì)是心中痛,一碰就要抓狂。沒(méi)辦法,誰(shuí)讓導(dǎo)師發(fā)話了,WB 做不好,延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道,WB 想說(shuō)愛(ài)你不容易。那么為了*馴服 WB,獲得漂亮且理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,一個(gè)良好的參照體系就絕對(duì)是*的存在。 

    一般而言,良好的參照體系包括: 

    *體重計(jì)(分子量 marker):可確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小 

    *光桿司令(空白對(duì)照):不加一抗和二抗,用于檢測(cè)膜的性質(zhì)的封閉效果 

    *好榜樣(陽(yáng)性對(duì)照):已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照,可檢測(cè)抗體的工作效率


    *打醬油的(陰性對(duì)照):不表達(dá)靶蛋白的組織或樣品,檢測(cè)抗體的特異性 

    *單飛者(二抗對(duì)照):不加一抗,檢測(cè)二抗的特異性。 

    *校正者(內(nèi)參對(duì)照):檢測(cè)標(biāo)本系統(tǒng)和抗體系統(tǒng),減少蛋白定量、上樣過(guò)程中的誤差



    內(nèi)參君的初次登場(chǎng) 

    在此,小編就帶領(lǐng)大家一起來(lái)認(rèn)識(shí)認(rèn)知這位“有名"的內(nèi)參君吧。內(nèi)參(Internal Control),簡(jiǎn)而言之,一般指的是由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins),因其表達(dá)恒定被用于檢測(cè)蛋白表達(dá)水平變化時(shí)的參照物,可確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。



    搞定內(nèi)參,駕馭 Western blot 已成功一半

    Tips: 

    1)在一些文獻(xiàn)報(bào)道中,Erk2、TATA bindingprotein(TBP)以及 c-Jun、c-Fos 等也可被用于核蛋白的內(nèi)參。 

    2)內(nèi)參的選擇需要考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。 

    eg:在細(xì)胞增殖相關(guān)試驗(yàn)中,c-Jun 由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí),TBP、Lamin 等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn),在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常,應(yīng)考慮這方面因素。



    搞定內(nèi)參,駕馭 Western blot 已成功一半



    鋒芒畢露的內(nèi)參君 

    正所謂,養(yǎng)兵千日,用在一時(shí)??墒呛芏鄬?shí)驗(yàn)菜鳥在選好內(nèi)參之后,對(duì)下一步如何發(fā)揮內(nèi)參君的本領(lǐng)感到一愁莫展。那么以下三個(gè)妙招可一解大家的燃眉之急。 

    1、超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法:只要在二抗孵育時(shí)加入 HRP 標(biāo)記內(nèi)參抗體,按照正常操作即可。 

    2 、普通內(nèi)參:當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí),可以*行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用膜再生液(P1650)洗掉膜上的抗體,重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。

    3 、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染,根據(jù)蛋白質(zhì) Marker 的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?,使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育,二抗溫育以及顯色。 如此下來(lái),各位小伙伴就可以坐等鋒芒畢露的內(nèi)參君為我們擒獲漂亮且理想的內(nèi)參圖片。





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