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    實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化(三)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-12  點(diǎn)擊次數(shù): 1793次

    本期介紹設(shè)計(jì)引物,得到實(shí)時(shí)熒光PCR引物對(duì),這種方法也可以用于普通PCR。


    1、長(zhǎng)度應(yīng)該在18~30bp,保證結(jié)合的特異性。


    2、熔解溫度(Tm值)應(yīng)在55~60°C,兩條引物的Tm值應(yīng)相差2~3°C。


    3、每條引物3'端應(yīng)該有1~3個(gè)鳥嘌呤或胞嘧啶,這樣做可以減少PCR過程中的非特異性擴(kuò)增。超過3個(gè)時(shí)會(huì)起反作用,發(fā)生“滑動(dòng)效應(yīng)"導(dǎo)致錯(cuò)誤延伸。


    4、引物的GC含量應(yīng)該在50%左右,過高的GC含量會(huì)升高Tm值。


    5、引物中應(yīng)該避免反向重復(fù)序列,因?yàn)檫@會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),影響引物結(jié)合在模板上。


    6、如果是RT-PCR,還需要避免設(shè)計(jì)引物結(jié)合在外顯子序列上,會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽性。正確做法應(yīng)設(shè)計(jì)在長(zhǎng)內(nèi)含子側(cè)翼、或短內(nèi)含子上,又或者是跨越外顯子-外顯子交界區(qū)。


    7、對(duì)引物進(jìn)行脫鹽純化。


    需要注意的是,有時(shí)候當(dāng)你做到了所有要點(diǎn),引物還是有可能無法擴(kuò)增,這時(shí)候就要重新設(shè)計(jì)引物啦。


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