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    誘導(dǎo)與檢測(cè)方法

    發(fā)布時(shí)間: 2022-02-28  點(diǎn)擊次數(shù): 1446次

    同學(xué)A:


    使用細(xì)胞細(xì)胞包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)板,將傳代或復(fù)蘇凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板上,密度為2×105 -3×105 cells/cm2或2×105 -3×105 cells/孔,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí),小心的將孔內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉,向6孔板中加入2mL人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基(此套裝包含基礎(chǔ)500ml,脂肪細(xì)胞分化因子:5ml,干細(xì)胞生長(zhǎng)維持因子:5ml,胎牛血清:25ml ),以此記為第0天。



    一、細(xì)胞誘導(dǎo)前可使用多聚賴氨酸溶液進(jìn)行細(xì)胞包被,以便細(xì)胞更好的進(jìn)行貼壁。



    二、每隔1-2天更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基;

    注意:為防止脂肪細(xì)胞脫落,建議誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞結(jié)節(jié)之后,換液形式變?yōu)槊刻煲淮伟肓繐Q液。


    三、 誘導(dǎo)14-21天期間,視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況進(jìn)行染色。







    以下是總結(jié)的染色方法     

    脂肪油紅染色,有的是動(dòng)物/人體脂肪組織切片,或細(xì)胞爬片。各有操作稍有差異。


    *成熟飽滿的脂肪細(xì)胞,容易破裂,脂滴泄漏,所以壓片,切片都要考慮到這個(gè)問(wèn)題。 


    細(xì)胞爬片細(xì)胞溶液脫落,特別是脂滴大的。操作務(wù)必要輕柔。不要把細(xì)胞沖掉。


    如果做脂肪組織冰凍切片,冰凍切片要適當(dāng)厚一些,一般為10-15µm,切片太薄容易導(dǎo)致脂肪流失


    如果培養(yǎng)載體為塑料制品,hoechst33342染核的話,塑料板自發(fā)熒光也為藍(lán)色,必須考慮波長(zhǎng),激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)=485nm/572nm



    誘導(dǎo)的小鼠MMSC-BM的成脂肪細(xì)胞

    染色步驟:

    (1) 先小心輕緩倒去培養(yǎng)液。 
    (2) 用pbs輕緩漂洗。
    (3)加10%中性甲醛或者95%以上的酒精固定30min以上
    (4) 稀釋改良型即用油紅染色試劑盒,油紅:PBS=3:2,室溫放置10min
    (5)染色10-20min左右,加的體積覆蓋住板底即可,如6孔加1.5ml,24孔加0.5-1ml。
    (6)脫色,用75%酒精/60%異丙醇漂洗,除去多余的染料

    (7) 復(fù)染,淡蘇木染色1/5分鐘,pbs漂洗(這一步不做也可,看試驗(yàn)需要,并且蘇木素會(huì)把胞漿染紅,如要顯示核, hoechst33342也可以,濃度5微克/毫升染10分鐘即可把核染上)。
    (8)甘油明膠封片(封片后可長(zhǎng)期保存)。

    (9) 若不用明膠封片,請(qǐng)盡快拍照。


    同學(xué)B:

    油紅O染色試劑盒在傳代培養(yǎng)中,接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時(shí),間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高,而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)則需要較高的細(xì)胞密度,這可能與分化時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過(guò)程中,若細(xì)胞過(guò)度融合會(huì)促進(jìn)其分化趨向,故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài),要及時(shí)傳代。


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