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    一氧化氮合酶組化顯示法

    發(fā)布時(shí)間: 2023-01-13  點(diǎn)擊次數(shù): 1071次

    簡介

    細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的輔酶,可以將孵育液中的底物脫氫,然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)(NBT),使后者還原成藍(lán)黑色沉淀。

    原理

    一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本原理是細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的輔酶,可以將孵育液中的底物脫氫,然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)(NBT),使后者還原成藍(lán)黑色沉淀,此即 NADPH 所在部位,也可代表 NOS 的所在部位。

    材料與儀器

    器材:

    染色缸、載玻片、蓋片、24孔板、毛筆、解剖器材、灌注器材、冰凍切片機(jī)、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠。

    試劑:


    ①孵育液(NADPH、NBT)
    (還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),3 mg ;硝基四氮唑藍(lán)(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L  PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL );
    ②0.1 mol / L 磷酸緩沖液(PB)


    (磷酸二氫鈉(NaH2PO4•2H2O),3 g ;磷酸氫二鈉(Na2HPO4•12H2O),29 g ;加少量蒸餾水,調(diào) pH 7.2~7.4,最后定容至1000 mL );

    ③1%Triton X-100。
    ④3%Triton X-100
    ⑤1%中性紅
    ⑥梯度乙醇
    ⑦0.01 mol / L PBS
    ⑧4%多聚甲醛
    ⑨中性樹膠

    步驟

    一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本過程可分為如下幾步:


    (一)腦組織冰凍切片


    A.將大鼠常規(guī)灌注固定,取腦組織塊,浸30%蔗糖后行冰凍切片(片厚40 μm )。

    B.將切片浸入0.1 mol / L 磷酸緩沖液(0.1 mol / L PB,pH 7.2~7.4)中漂洗10 min ,重復(fù)3 次 。

    C.1%Triton X-100(用0.1 mol / L PB配制,pH7.4)中,室溫,預(yù)浸60 min 。

    D.浸入孵育液中孵育,37 ℃ ,3 h 。

    E.3%Triton X-100,4 ℃ ,過夜。

    F.0.1 mol / L PB中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

    G.裱片,風(fēng)干。中性紅復(fù)染。

    H.常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

    (二)細(xì)胞爬片或甩片


    A.細(xì)胞爬片或甩片,0.01 mol /L PBS漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

    B.4%多聚甲醛固定,室溫,30 min 。

    C.0.01 mol / L PBS漂洗10 min ,重復(fù)3 次 。

    D.按上述腦組織冰凍切片步驟(3)~(6)操作。

    E.中性紅復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

    注意事項(xiàng)

    1.冰凍切片采用的是漂浮法,有利于孵育液充分進(jìn)入組織。

    2.本方法屬于酶組化,要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉颓‘?dāng)?shù)墓潭〞r(shí)間和方法,否則會(huì)影響酶的活性。

    3.此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果,降低非特異性背景染色。但 Triton X-100 預(yù)浸時(shí)間不能超過2 h ,孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2%,否則影響著色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ,防止 NBT 難溶。


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