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    如何優(yōu)雅地獲得漂亮小分子蛋白條帶

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-17  點(diǎn)擊次數(shù): 1460次

    做過(guò) Western-Blot 的童鞋知道,分子量小于 30KDa 的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍,我待小分子蛋白如初戀。抱怨是沒(méi)用的,想方設(shè)法解決問(wèn)題才是正道。一次又一次的調(diào)整方案,一次又一次的徒勞無(wú)功。在此,總結(jié)了小分子蛋白之路經(jīng)驗(yàn),供有需求的童鞋參考。


    一、提蛋白的過(guò)程在 30 分鐘之內(nèi)完成,提完蛋白立即加入上樣緩沖液煮沸(煮沸的時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),一般 20 分鐘),準(zhǔn)備好蛋白樣品后立即電泳。(小分子蛋白容易形成多聚體,這樣可以大大減少多聚體的形成)。


    二、電泳時(shí),電泳的時(shí)間要足夠長(zhǎng)。習(xí)慣是先用 60-80V 電壓跑完濃縮膠,再以 100-120V 電壓跑分離膠,溴酚藍(lán)電泳至玻璃板底部。伯樂(lè)系列的電泳槽一般電泳 2 個(gè)小時(shí)左右,GE 以及百晶系列的電泳槽要電泳 4 到 5 個(gè)小時(shí)。電泳時(shí)要在冰水浴中進(jìn)行。最好用 1mm 和 1.5mm 厚的膠(若用 0.75mm 厚的膠時(shí)要適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間)。


    三、轉(zhuǎn)膜時(shí),盡量用濕轉(zhuǎn)法(半干轉(zhuǎn)也可以,但是容易轉(zhuǎn)過(guò))。轉(zhuǎn)膜緩沖液中,甲醇濃度要達(dá)到 20%。PVDF 膜,財(cái)大氣粗的土豪可以用 0.22 微米的膜。對(duì)于我們大多數(shù)窮人來(lái)說(shuō),0.45 微米的膜也是可以的。以下是摸索出來(lái)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間(濕轉(zhuǎn)法,0.45 微米的膜),供大家參考。


    如何優(yōu)雅地獲得漂亮小分子蛋白條帶


    四、一抗孵育因?yàn)槎鄶?shù)小分子蛋白的表達(dá)量較少,所以我一般孵育至少 48 個(gè)小時(shí),甚至孵育 72 個(gè)小時(shí)。以上方法適用于分子量在 20-30KDa 的蛋白。若蛋白分子量小于 15KDa,則不用 SDS-PAGE 凝 膠電泳(蛋白與 SDS 共遷移,影響分離度,得不到很好的分離效果),應(yīng)該采用 Tris-Tricine 緩沖系統(tǒng)與 Tricine 分離膠。具體操作步驟見(jiàn)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南》338-340 頁(yè)(這本書每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必會(huì)備,若沒(méi)有,可以在孔夫子舊書市場(chǎng)上買一本)。


    需要注意的是,Tricine 電泳時(shí),蛋白樣品用 Tricine 樣品緩沖液處理,加樣前在 37-40℃沙浴中處理一個(gè)小時(shí)(不要煮沸!不要煮沸!不要煮沸!重要的事情說(shuō)三遍)。內(nèi)槽中加滿陰極緩沖液,外槽中加滿陽(yáng)極緩沖液(千萬(wàn)不要加反了。否則蛋白全部進(jìn)入緩沖液?。?。 

    最后,祝做小分子蛋白的童鞋實(shí)驗(yàn)之路順利,早日做出滿意的結(jié)果。

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